Calcolatore della Temperatura di Fusione del DNA
Stima la temperatura di fusione (Tm) di un primer di DNA dalla sua sequenza.
Vengono contate solo le basi A, T, G e C (senza distinzione tra maiuscole e minuscole). Qualsiasi altro carattere viene ignorato.
Temperatura di Fusione Stimata (Tm)
°C
Lunghezza della Sequenza (n)
Contenuto GC
Tm Regola di Wallace
Tm Formula %GC
Composizione delle Basi
Cos’è la Temperatura di Fusione del DNA?
La temperatura di fusione (Tm) di una sequenza di DNA è la temperatura alla quale metà delle molecole di DNA a doppio filamento in un campione si sono separate (denaturate) in singoli filamenti. È una proprietà chiave di qualsiasi primer o oligonucleotide, poiché la forza dell’appaiamento delle basi determina la facilità con cui i due filamenti si separano quando riscaldati.
Le coppie di basi G–C sono tenute insieme da tre legami a idrogeno, mentre le coppie A–T ne condividono solo due. Le sequenze più ricche di G e C tendono quindi ad avere una Tm più alta. Anche la lunghezza della sequenza è importante: i duplex più lunghi sono più stabili e fondono a temperature più elevate.
Regola di Wallace vs Formula del %GC
Regola di Wallace (oligo corti, n < 14)
Chiamata anche "regola 2+4", fornisce una stima rapida per i primer corti:
Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C) °C
È semplice e funziona ragionevolmente bene per oligo di meno di circa 14 basi, ma ignora la concentrazione di sale, la concentrazione di oligo e la struttura a lungo raggio, diventando quindi inaffidabile per sequenze lunghe.
Formula del %GC (sequenze lunghe, n ≥ 14)
Per sequenze più lunghe, una formula basata sul contenuto GC fornisce una stima migliore:
Tm = 64,9 + 41 × (G + C − 16,4) / (A + T + G + C) °C
Questa formula tiene conto sia della lunghezza che del contenuto GC. Resta comunque un’approssimazione: non modella il sale né la concentrazione dei filamenti, e per lavori precisi i ricercatori usano modelli termodinamici nearest-neighbour.
La Tm nella Progettazione di Primer per PCR
In una reazione a catena della polimerasi (PCR), la temperatura di annealing viene di solito impostata alcuni gradi al di sotto della Tm dei primer. Scegliere una buona Tm aiuta i primer a legarsi specificamente al loro bersaglio.
- Punta a primer con una Tm di circa 52–62 °C per la PCR standard.
- Mantieni la Tm di una coppia di primer forward e reverse entro circa 5 °C l’una dall’altra.
- La temperatura di annealing è spesso impostata circa 3–5 °C sotto la Tm del primer più bassa.
- Un contenuto GC molto alto può causare strutture secondarie stabili; un GC molto basso può ridurre la specificità .
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Avviso Educativo: Questo calcolatore della temperatura di fusione del DNA fornisce stime approssimative basate su formule semplificate (la regola di Wallace e una formula del contenuto GC). Queste non tengono conto della concentrazione di sale, della concentrazione di oligonucleotide, dei mismatch né della struttura secondaria. Per una progettazione sperimentale che richieda alta precisione, utilizza modelli termodinamici nearest-neighbour e protocolli di laboratorio convalidati.